光學(xué)顯微鏡的使用及示教片的觀察

        一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)和掌握油杯的使用原理和方法。 2、復(fù)習(xí)普通臺(tái)式顯微鏡各部分的結(jié)構(gòu)、功能和使用方法。 2、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和油鏡的工作原理?，F(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡采用目鏡和物鏡兩種透鏡系統(tǒng)進(jìn)行放大成像，因此常被稱(chēng)為復(fù)合顯微鏡。它們由兩部分組成：機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。在普通光學(xué)顯微鏡常用的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)，是微生物研究中最重要的。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需要在載玻片和鏡頭之間加一滴鏡頭油。這主要是以下兩個(gè)原因： 1. 增加照明油透鏡的亮度，放大倍數(shù)可以達(dá)到100 Χ，這么大的放大倍數(shù)的鏡頭焦距短，直徑小，但所需的光強(qiáng)是的。載有標(biāo)本的載玻片發(fā)出的光，由于介質(zhì)密度不同（從載玻片進(jìn)入空氣，再進(jìn)入透鏡），部分光線會(huì)因折射或全反射而無(wú)法進(jìn)入透鏡，導(dǎo)致使用油鏡由于光線較少，物體的圖像不清晰。因此，為了不損失通過(guò)的光線，在使用油鏡時(shí)，必須在油鏡和玻璃（通常是雪松油，其折射率為指數(shù)為 n = 1.52）。 2、提高顯微鏡的分辨率 顯微鏡的分辨率或分辨力是指顯微鏡分辨兩點(diǎn)之間最小距離的能力。從物理角度來(lái)看，光學(xué)顯微鏡的分辨率受光干涉現(xiàn)象和所用物鏡性能的限制。分辨率D可以表示為：D=λ/2N.A，其中λ=光的波長(zhǎng)； NA=物鏡數(shù)值孔徑值。光學(xué)顯微鏡的光源不能超過(guò)可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍（0.4-0.7μm），數(shù)值孔徑值取決于物鏡的透鏡角度和載玻片與透鏡之間介質(zhì)的折射率，可表示為： NA=n × 在sin α的公式中，α為光入射角的一半。這取決于物鏡的直徑和焦距。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)際應(yīng)用中只能達(dá)到120 O，n為介質(zhì)的折射率。由于雪松油的折射率 (1.52）高于空氣和水的折射率（分別為1.0和1.33），所以以雪松油為介質(zhì)的鏡片與玻璃之間的油鏡所能達(dá)到的數(shù)值孔徑值（NA一般為1.2-1.4）為更高 適用于低倍鏡和高倍鏡（NA低于1.0）等干式鏡片。如果以可見(jiàn)光的平均波長(zhǎng)0.55μm計(jì)算，數(shù)值孔徑通常在0.65左右的高倍透鏡只能分辨距離不小于0.4μm的物體，而油性透鏡的分辨率可以達(dá)到0.2μm左右.三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 1、菌株：枯草芽孢桿菌染色玻片標(biāo)本。青霉菌（Penicillium sp.）水封等（教師可根據(jù)具體情況選擇菌種）。 2、溶液或試劑：雪松油、乙醇：yi醚混合物 3、儀器或其他用具：顯微鏡、擦鏡紙等 4、操作步驟 1、觀察前的準(zhǔn)備 （1）顯微鏡的放置：將顯微鏡放在平板實(shí)驗(yàn)臺(tái)，鏡頭卡口距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約3-4cm。顯微鏡檢查時(shí)姿勢(shì)應(yīng)正確。用一只手握住顯微鏡的臂，另一只手握住底座，以保持顯微鏡直立和穩(wěn)定。不要用一只手搬運(yùn)；無(wú)論您使用單目顯微鏡還是雙目顯微鏡，都應(yīng)同時(shí)睜開(kāi)雙眼進(jìn)行觀察，以減少眼睛疲勞，同時(shí)也便于在繪圖或記錄時(shí)進(jìn)行觀察。 (2)光源調(diào)節(jié)：安裝在鏡架上的光源燈可以通過(guò)電壓調(diào)節(jié)，以獲得合適的照明亮度，當(dāng)使用反射器收集自然光或光作為照明光源時(shí)，應(yīng)根據(jù)光源的強(qiáng)度和物鏡的放大倍數(shù)采用凹面或凸面反射鏡并調(diào)整其角度，使視場(chǎng)內(nèi)光線均勻，亮度適宜。 (3)根據(jù)用戶(hù)的個(gè)人情況調(diào)整雙目顯微鏡的目鏡。雙目顯微鏡的目鏡間距可以適當(dāng)調(diào)節(jié)，左目鏡一般配有屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，可以適應(yīng)不同的眼距或視力。不同觀察者的差異。 (4)聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)聚光器的光圈孔徑值，使其與物鏡的數(shù)值孔徑值一致或略低。有些顯微鏡的聚光鏡只標(biāo)注了數(shù)值孔徑值，并沒(méi)有具體的孔徑刻度。使用本顯微鏡時(shí)，可以在樣品聚焦后取下目鏡，在從鏡筒觀察視野的同時(shí)放大光圈。調(diào)整光圈邊緣與物鏡黑圈相切或略小于其邊緣。.由于每個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑不同，每次更換物鏡時(shí)都要進(jìn)行這種調(diào)整。聚光鏡的數(shù)值孔徑值確定后，如果需要改變光強(qiáng)，可以通過(guò)升降聚光鏡或改變光源的亮度來(lái)實(shí)現(xiàn)。原則上不應(yīng)通過(guò)虹彩光圈進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然，虹彩光圈的使用原理、聚光鏡的高度和照明光源的強(qiáng)度都不是固定的。只要能獲得良好的觀察效果，有時(shí)可以根據(jù)不同的具體情況靈活使用，不一定是固定的。 2、對(duì)于顯微觀察，在目鏡不變的情況下，不同倍率物鏡所能達(dá)到的分辨率和放大倍數(shù)是不同的。一般情況下，特別是初學(xué)者，在進(jìn)行顯微觀察時(shí)，應(yīng)遵循從低倍到高倍再到油鏡的觀察程序，因?yàn)榈捅段镧R的視場(chǎng)比較大，容易找到目標(biāo)和確定檢查位置。 (1)低倍觀察金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本。將載玻片放在載物臺(tái)上，用樣品夾夾住，移動(dòng)推進(jìn)器，使觀察對(duì)象直接位于物鏡下方。降低 10X 物鏡使其靠近樣品。用粗調(diào)器慢慢抬起鏡筒，使標(biāo)本初步聚焦在視野內(nèi)，然后用微調(diào)器將圖像調(diào)得清晰。緩慢移動(dòng)載玻片通過(guò)載玻片夾推桿，仔細(xì)觀察標(biāo)本的各個(gè)部位，找到合適的目標(biāo)，仔細(xì)觀察并記錄觀察結(jié)果。任何時(shí)候用粗調(diào)器對(duì)圖像進(jìn)行調(diào)焦時(shí)，要養(yǎng)成從側(cè)面仔細(xì)調(diào)整靠近標(biāo)本的物鏡*的習(xí)慣，然后用目鏡觀察，慢慢調(diào)整遠(yuǎn)離標(biāo)本的物鏡準(zhǔn)直，以免暫時(shí)誤操作。損壞鏡頭和載玻片。 (2) 用高倍鏡觀察。在低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心后，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)，將高倍鏡移至工作位置。適當(dāng)調(diào)整聚光器孔徑和視野亮度后，微調(diào)微調(diào)器使物像清晰，用螺旋槳移動(dòng)試樣仔細(xì)觀察并記錄觀察結(jié)果。一般情況下，當(dāng)物像已經(jīng)在物鏡中清晰聚焦后，物鏡轉(zhuǎn)至工作位置觀察時(shí)，物像基本保持在焦點(diǎn)上。這種現(xiàn)象稱(chēng)為物鏡共焦（parfocal）。利用這種共焦現(xiàn)象，可以保證在使用高倍率或高倍率短工作距離的油鏡時(shí)，僅用微調(diào)器就可以清晰聚焦物像，避免使用粗調(diào)器的可能.誤操作損壞鏡頭或載玻片。 (3)油鏡觀察高倍鏡或低倍鏡找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)器將鏡筒抬高，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)加一滴雪松油，從側(cè)面看，用粗調(diào)器小心地降低鏡筒，使油鏡浸入鏡油中，幾乎與鏡筒接觸。標(biāo)本。將聚光鏡升至位置并打開(kāi)全孔徑。如果使用的冷凝器的數(shù)值孔徑超過(guò) 1.0，請(qǐng)?jiān)诶淠骱洼d玻片之間加入一滴雪松油，以確保其效率。調(diào)整照明，使視野的亮度合適。使用粗調(diào)器緩慢抬起鏡筒，直到視野中出現(xiàn)物體圖像，然后使用微調(diào)器使其清晰對(duì)焦。有時(shí)按上述操作找不到目標(biāo)物體，可能是油鏡沒(méi)有降到位，或者油鏡升得太快，使眼睛無(wú)法捕捉到經(jīng)過(guò)物體的圖像。在這種情況下，您應(yīng)該重新操作。此外，要特別注意不要在降低鏡頭時(shí)用力過(guò)大或在調(diào)整焦距時(shí)錯(cuò)誤地將粗調(diào)器向相反方向轉(zhuǎn)動(dòng)而損壞鏡頭和載玻片。三、顯微鏡使用后的處理 (1) 抬起鏡筒，取下載玻片。 (2)用擦鏡紙擦去鏡頭上的擦鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（雪松油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油，最后用干凈的鏡頭清潔紙 去除殘留的二甲苯。 (3)用鏡頭清潔紙清潔其他物鏡和目鏡；用絲布清潔顯微鏡的金屬部分。 (4)還原各部分，反射鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八"字形，然后向下旋轉(zhuǎn)。同時(shí)，降低聚光鏡以避免物鏡和聚光鏡碰撞的風(fēng)險(xiǎn)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1、畫(huà)出你在低倍、高倍和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和青霉菌的形態(tài)，包括三種情況下的視野品種。還要注明物鏡放大倍數(shù)和總放大倍數(shù)。六、問(wèn)題 1、用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？載玻片和鏡片之間加什么油？它扮演什么角色？ 2、測(cè)試單比較了低倍鏡、高倍鏡和油鏡的區(qū)別。為什么在使用高倍鏡和油鏡時(shí)要特別注意避免粗調(diào)器誤操作？ 3、物鏡的共焦現(xiàn)象是什么？它在顯微觀察中有什么意義？ 4、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ 5.根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，談?wù)勅绾胃鶕?jù)觀察微生物的大小選擇不同的物鏡進(jìn)行有效觀察。